人外周血白細胞分離液實驗方法WBC1077k
（細胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)）
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
|
|
| 名稱 | 產(chǎn)品編號 |
| 規(guī)格 |
| ||
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
| A | 人外周血白細胞分離液 |
|
|
| 200ml |
| ||
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
| B | 樣本稀釋液（贈品） | 2010C1119 |
| 200ml |
| |||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| C | 清洗液（贈品） |
|
| 2010X1118 |
| 200ml |
| |
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
| D | 紅細胞裂解液（贈品） | NH4CL2009 |
| 100ml |
| |||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| E | 說明書 |
|
|
|
|
| 1 份 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
【實驗前準備】 |
|
|
|
|
|
|
| ||
A． 適用儀器 |
|
|
|
|
|
|
| ||
| zui大離心力可達 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機 |
|
|
|
|
| |||
B． 耗材 |
|
|
|
|
|
|
|
| |
|
|
|
|
|
|
|
| ||
| 產(chǎn)品名稱 |
| 產(chǎn)品貨號 |
| 產(chǎn)地 |
|
| ||
|
|
|
|
|
|
|
| ||
| 15ml 離心管散裝 |
| 339650 |
| 美國 NUNC |
|
| ||
|
|
|
|
|
|
|
| ||
| 15ml 離心管架裝 |
| 339651 |
| 美國 NUNC |
|
| ||
|
|
|
|
|
|
|
| ||
| 50ml 離心管散裝 |
| 339652 |
| 美國 NUNC |
|
| ||
|
|
|
|
|
|
|
| ||
| 50ml 離心管架裝 |
| 339653 |
| 美國 NUNC |
|
| ||
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
| 無菌膠頭滴管或塑料滴管 |
|
|
|
|
|
|
| |
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
【檢驗方法】 |
|
|
|
|
|
|
| ||
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。
首先取抗凝血，根據(jù)樣本量大小，分以下兩種情況：
情況 A：血液樣本量小于 5ml 時，實驗方法如下：
1. 取一支 15ml 離心管，先加入 5ml 分離液
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注：如改
變血液樣本及分離液用量，需相應(yīng)調(diào)整離心力及離心時間，具體離心條件需客戶自行摸
索，以達到分離效果。）
3. 離心后用吸管小心吸取所有環(huán)狀乳白色細胞層（一層或兩層），加入 10 ml 清洗液（產(chǎn) 品編號：2010X1118），混勻細胞。250g，離心 10min。重復(fù)洗滌 2-3 次，即得所需白細 胞。
4. 如有紅細胞殘留請使用紅細胞裂解液（產(chǎn)品編號：NH4CL2009）裂解紅細胞，具體操
作方法詳見“紅細胞裂解液使用說明”。
情況 B：血液樣本量大于等于 5ml 時，實驗方法如下：
1. 取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，先加入與樣本等量的分離液。
2. 將血液樣本小心加于分離液之液面上，450-650g（zui大離心力可至 1000g），離心 20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心 時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到分離效果。加入血液樣本后，樣 本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二）。
3. 剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 與步驟 4。
【注意事項】
1. 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得的實驗結(jié)果，zui 好在取血 2h 內(nèi)進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后 分離效果更差甚至不能達到分離目的。
2. 本實驗不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導(dǎo)致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會變成毛面，影響細胞分離效果。
3. 分離液用量大于稀釋后血液樣本時，分離效果更佳。
4. 當(dāng)血液樣本粘度過高需稀釋時，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號： 2010C1119）1:1 稀釋混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞档图毎寐始盎钚浴Ｈ缪簶?本經(jīng)過稀釋則分離過程中需適當(dāng)降低離心力和離心時間。
5. 如實驗后細胞得率或活性過低，請以尋求幫助，具體詳 見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
【儲存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實驗白細胞提取率及純度大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進行參考。
| 紅細胞 |
| 白細胞 |
| 血小板 |
|
|
|
|
|
|
|
| （4.0-10.0）×109 |
| ||
含量（個/L） | （4.0-5.5）×1012 | 中性粒細胞 | 淋巴細胞 | 單核細胞 | （1.0-3.0）×1011 |
|
| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
|
|
|
|
|
|
|
【相關(guān)實驗技術(shù)方案】
1. 所獲得白細胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2. 所獲得白細胞的核酸提取技術(shù)。
3. 所獲得白細胞的鑒定方法 A.流式細胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù) C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù)
注：上述技術(shù)方案詳情請登陸本搜索“細胞分離、
純化、擴增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊”，并在說明書項目欄下下載使用。
【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
|
|
|
|
|
離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
|
|
|
| |
離心后目的細胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長 |
| |
|
| ||
|
|
|
|
離心后白環(huán)層彌散 | 細胞密度過大 | 調(diào)整細胞密度 |
|
|
|
| |
離心后白環(huán)層太淺或看不見 | 細胞密度過小 |
| |
|
| ||
|
|
|
|
2. 本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進行調(diào)整時，恒定離 心時間，對離心轉(zhuǎn)速進行調(diào)整。
3. 本分離液依照標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可 能出現(xiàn)紅細胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對離心條件進行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達到分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。
